PCR實(shí)驗(yàn)室在操作時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)

  PCR檢測(cè)微量感染因子時(shí)，容易因?yàn)槲廴镜亩鴮?dǎo)致各種問(wèn)題，因此，進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，*大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染出現(xiàn)。

　　(1)劃分操作區(qū)：

　　目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：

　　①標(biāo)本處理區(qū)，包括：擴(kuò)增摸板制備;

　　②PCR擴(kuò)增區(qū)，包括：反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增;

　　③產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。

　　※各工作區(qū)要具有一定隔離，操作器材專用，要有一定方向性，如，標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

　　切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

　　(2)分裝試劑：

　　PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝，所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源DNA：

　　①PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;

　　②引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制;

　　③引物和d-NTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因;

　　(3)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

　　盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。

　　因此：不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

　　①戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套;

　　②使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染;

　　③避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

　　④操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度;

　　⑤*后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管;

　　⑥操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性;

　　⑦盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器*容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，*好使用可替換或高壓處理的加樣器。如，沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū);

　　⑧重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

　　PCR擴(kuò)增重要標(biāo)準(zhǔn)

　　什么是PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度?

　　靈敏度指的是PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠檢測(cè)到目的基因*小值。研究結(jié)果表明，影響PCR擴(kuò)增效率的因素，如，模板的復(fù)雜程度與完整性、引物純度及其與模板結(jié)合效率、反應(yīng)溫度、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴(kuò)增性能、反應(yīng)緩沖液的離子組成(主要指：陽(yáng)離子)、反應(yīng)優(yōu)化劑等，均決定PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度。在*佳擴(kuò)增條件下，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)到pg(10～12g)數(shù)量級(jí)目的基因。對(duì)于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系(包括：DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等)就是研究者提高PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度的關(guān)鍵因素了。

　　與實(shí)驗(yàn)室自配PCR擴(kuò)增體系相比，東盛Taq Mix對(duì)反應(yīng)緩沖液中的成分進(jìn)行優(yōu)化，并加入了適當(dāng)比例的反應(yīng)增強(qiáng)劑(PCR Enhancer)，提高DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR擴(kuò)增性能影響，使得DNA聚合酶處于*適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高檢測(cè)靈敏度。即時(shí)反應(yīng)體系中只有幾個(gè)目的基因拷貝，也能輕松檢測(cè)。

　　什么是PCR實(shí)驗(yàn)特異性?

　　特異性指的是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，專一性擴(kuò)增目的片段而非其他片段的性能。在PCR實(shí)驗(yàn)本身的靈敏度很高，且實(shí)驗(yàn)條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會(huì)在目的片段出現(xiàn)同時(shí)伴隨有其他雜帶，即，發(fā)生非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件控制等均會(huì)影響PCR擴(kuò)增特異性。近年，研究結(jié)果表明，緩沖液品質(zhì)(如，離子種類與組成，反應(yīng)優(yōu)化劑等)對(duì)保證PCR特異性擴(kuò)增起著不可忽視的作用。一般緩沖液中調(diào)節(jié)氫鍵作用鹽只有KCl，而東盛HSTMTaq Mix的緩沖體系通過(guò)反應(yīng)優(yōu)化劑以及KCl/(NH4)SO4鹽離子體系平衡調(diào)節(jié)，顯著提高PCR擴(kuò)增特異性，降低背景。

　　PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度與特異性是一對(duì)此長(zhǎng)彼消特性，這也決定我們實(shí)驗(yàn)體系調(diào)節(jié)實(shí)際上就是需要找到適合實(shí)驗(yàn)靈敏度與特異性平衡點(diǎn)。由于PCR體系中的眾多成分，使得組合較多，篩選工作繁雜。東盛基于靈敏度與特異性分別設(shè)計(jì)了PCR Mix和HS Taq Mix，幫您確定大平衡點(diǎn)，如果您需要更細(xì)致的平衡點(diǎn)，請(qǐng)選擇相應(yīng)的Mix Kit系列進(jìn)行微調(diào)。